Partindo-se de uma cultura do fungo
obtida de um fornecedor de culturas, dos esporos ou mesmo de um pedaço
do cogumelo ,devemos multiplicar esse micélio e guardar algumas
amostras para quando for necessário, produzirmos novamente os
cogumelos.
Fazemos isso preparando um meio de cultura
formulado à base de ágar + nutrientes que deve ser esterilizado
e inoculado com o micélio do fungo que se deseja produzir. A superfície
solidificada do meio de cultura fornece as condições adequadas
para o desenvolvimento do micélio e permite visualizar a presença
de contaminantes.
2.1
- Materiais Necessários:
Para o preparo do ágar nutritivo
podemos fazer uso de meios já prontos ,onde apenas adiciona-se água
destilada e depois de bem misturados , procedemos a esterilização
desse material em panela de pressão ou autoclave ou então formularmos
os ingredientes separadamente. Abaixo está descrita uma formulação
de meio de cultura que pode ser utilizada:.
Meio de cultura BDA
(Batata, dextrose, ágar)
Um dos meios mais utilizados é o
BDA , onde utilizamos batatas como fonte dos nutrientes. A formulação
abaixo é suficiente para se produzir 1 litro de meio de cultura.
Para outros volumes menores ou maiores, preparar os ingredientes proporcionalmente:
Batatas cruas – 200 g
Dextrose – 20 g
Ágar bacteriológico – 20 g
Água destilada – 1 litro
Extrato de leveduras– 2 g (opcional)
Sulfato de gentamicina - 0,1 g (usado para controlar bactérias)
A dextrose é um tipo de açúcar
, fornece os carboidratos necessários ao desenvolvimento do micélio.Podemos
usar o Dextrosol (marca comercial). O ágar é uma espécie
de gelatina obtido a partir de algas marinhas e que é usado como
agente gelificante. O extrato de leveduras é uma fonte de vitaminas
do complexo B e promove um crescimento exuberante do micélio quando
presente no meio de cultura. O ágar e o extrato de leveduras devem
ser adquiridos de empresas que vendem materiais para laboratório.A água
destilada pode ser a mesma que é vendida para uso em baterias
de automóveis. Na falta desta fazer testes com água mineral.
O sulfato de gentamicina deve ser utilizado sómente quando nâo
se consegue obter uma cultura livre de bactérias, caso contrário
fazer o meio de cultura sem usar esse antibiótico .Pode ser obtido
em farmácias de manipulação de fórmulas.
Lavar e escovar bem as batatas, retirando
os resíduos de terra aderidos. Cortar em fatias finas sem retirar
as cascas e ferver em 0,5 litro de água destilada até que
fique bem macia.
Filtrar o líquido reservando-o
e descartar as batatas cozidas. Adicionar ao filtrado , a dextrose ,o ágar
e opcionalmente o extrato de leveduras e o antibiótico. Acertar
o volume final para 1 litro com água destilada. Misturar manualmente
em banho-maria até dissolver bem o ágar. Não usar
batedeira ou liquidificador , pois será formada muita espuma que
não permitirá que o meio seja utilizado. Pode-se utilizar
aquecimento direto ao fogo para dissolução do meio de cultura
, porém deve-se agitar constantemente e usar fogo bem baixo para
evitar que o açúcar fique caramelizado , o que impedirá o
crescimento do micélio.
Preencher vários tubos com tampa
rosqueável (apenas 1/3 do volume) com o meio de cultura líquido
e tampar cada tubo deixando a tampa frouxa para que a pressão
se equalize durante a esterilização. Colocar os tubos em
estantes metálicas e colocar todo o conjunto dentro da panela
de pressão para proceder a esterilização do meio
de cultura. Seguir
o procedimento de esterilização de acordo com a página
de procedimento
para esterilização com panela de pressão, contando
o tempo de esterilização em 25 minutos em fogo bem baixo,
porém suficiente para emissão de vapor contínuo
pelo pino da panela de pressão.
Após passado o tempo de esterilização
,desligar o fogo e deixar a pressão interna da panela de pressão
baixar naturalmente. Importante :
não forçar o abaixamento da pressão levantando o
pino da panela de pressão , pois o meio de cultura dentro dos
tubos pode ferver com a diminuição da pressão interna
, chegando a sair completamente dos tubos .
Após abaixar totalmente a pressão
, abrir a panela de pressão e retirar os tubos de ensaio com o
meio ainda quente (usar luvas grossas bem limpas e esterilizadas com álcool
) e apoiá-los em um suporte de tal forma que fiquem levemente
inclinados (cerca de 15º de inclinação),deixando que
o meio se solidifique ao resfriar , aumentando dessa forma a superfície
de crescimento para o micélio no meio de cultura.
Esses tubos com o meio de cultura solidificado
em ângulo são agora chamados de tubo de ágar inclinado.
Para armazená-los por longo tempo , após o ágar
ter solidificado e resfriado totalmente , apertar bem a tampa rosqueável
e colocá-los dentro de sacos plásticos limpos , amarrar
a boca dos sacos e colocá-los em pé dentro do refrigerador
(não congelar), onde podem ser guardados por até 1 ano
em média.
Meio de cultura MEA
(extrato de malte + ágar)
Existem meios de cultura para uso
em cultivo de cogumelos que podem ser adquiridos pré-formulados
, bastando apenas que se adicione água destilada e se proceda
a esterilização dos mesmos. Uma das empresas que vendem
um excelente meio de cultura é a empresa americana Fungi
Perfecti (clique AQUI para
abrir a página inicial desse site ) .Se preferir , clique AQUI para
ir direto à página do meio de cultura Malt Extract Agar
(MEA) vendido pela empresa Fungi Perfecti.
Uma das desvantagens é o preço
cotado em dólares, porém muitas vezes desejamos trabalhar
com rapidez, pois só estamos pesando um único componente
para o preparo do meio.Nas empresas nacionais que vendem material para
laboratório de biologia , podemos encontrar meios de cultura
prontos , devendo-se adquirir meios nutritivos específicos para
cultura de micélio de cogumelos.
Devemos evitar os meios prontos para
cultivo de fungos filamentosos (bolores) , pois esses não são
balanceados para o crescimento do micélio de cogumelos e sim
para o crescimento do micélio de contaminantes.
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