A produção de uma cultura a partir
de esporos implica na coleta desses esporos de forma asséptica e fazer
sua germinação em meio nutritivo sólido (ágar + nutrientes). Nesse
tipo de reprodução é necessária a combinação de no mínimo dois esporos
para se produzir um micélio viável. Devido à variabilidade genética
ocorrida entre os diversos cruzamentos dentre os milhares de esporos
coletados , serão obtidas diversas culturas que podem ser ou
não mais produtivas que a do cogumelo que originou os esporos. Por
outro lado podemos fazer melhoramentos genéticos de uma cultura de
cogumelos por cruzamento entre esporos de várias origens e estudarmos
a produtividade e resistência aos contaminantes de cada combinação
obtida. A reprodução por meio de esporos é chamada de reprodução sexuada.
Para obtermos uma cultura a partir
de esporos usamos uma placa de vidro (10x10 cm aproximadamente) esterilizada
com álcool e depois flambada com o bico de Bunsen.
Para isso, passar um algodão com álcool
sobre a placa de vidro (apoiada sobre a bancada) para desinfetá-la
e passar a chama do bico de Bunsen sobre a placa para flambá-la. Deixar
a placa esfriar próximo ao bico de Bunsen aceso. Esse método
não assegura uma coleta de esporos do cogumelos livres de esporos
de contaminantes. Posteriormente poderá ser necessária
a purificação
dessas culturas ou o seu total descarte , devido aos contaminantes.
Podemos também utilizar um método
mais adequado que é feito esterilizando-se as placas de vidro em panela
de pressão. Em primeiro lugar , limpar as placas que irão ser usadas
para coleta dos esporos com álcool .Deixar o álcool evaporar completamente
e embrulhar as placas individualmente com papel alumínio e proceder
a esterilização em panela de pressão por 30 a 60 minutos. Colocar um
suporte metálico dentro da panela de pressão de tal forma que as placas
fiquem bem acima do nível de água dentro da panela, fazendo com que
recebam o calor somente do vapor d´água. Deixar esfriar completamente
a panela antes de retirar as placas , para evitar que se quebrem por
choque térmico.
Podemos também usar placas de Petri
esterilizadas em panela de pressão ou autoclave, conforme descrito
acima ou ainda esterilizada em estufa à 150-180ºC por 1 hora (embrulhadas
em papel alumínio). Também devemos deixar
esfriar
totalmente
as
placas
de
Petri antes
de abrir a porta da estufa.
Devemos então escolher
um cogumelo bem limpo , cortar seu pé e suspender o "chapéu" com
as lamelas (parte inferior do "chapéu" do cogumelo)
viradas para baixo sobre a placa de vidro (ou placa de Petri) pré-esterilizada
, sem que o cogumelo toque a placa , cobrindo o conjunto com uma tampa
de
vidro
(ou com a tampa da placa de Petri se estiver usando uma placa de Petri
para coleta) para evitar o ressecamento do cogumelo e possíveis
contaminações
pelo ar.
Deixar o cogumelo por 12 a 24 horas
para que se obtenha uma boa deposição de esporos sobre a placa de vidro
(em inglês = spore print).(CLIQUE
AQUI)
Remover o cogumelo e descartá-lo.
Para preservar a coleta de esporos, colocar a outra placa de vidro,
também esterilizada , sobre a placa que se coletou os esporos
, selando os quatro lados das placas com tiras de esparadrapo.
Se a
coleta foi feita em placa de Petri, selar as laterais da placa
de Petri (já fechada com
a tampa) usando um material chamado Parafilm (CLIQUE
AQUI) . O
Parafilm é um filme plástico translúcido e auto-vedante que possui
a propriedade de ser esticado e aderir aos frascos de vidro , vedando-os
e sem deixar
qualquer resíduo, pois não utiliza cola .Na
falta deste usar esparadrapo para vedar as placas de vidro ou as
placas de Petri, porém o esparadrapo deixará resíduos de cola.
Se os esporos estiverem com aspecto úmido
, após serem coletados do cogumelo , deixar que sequem um pouco (sempre
sob a tampa de vidro mencionada acima) antes de serem cobertos pela
segunda placa de vidro. Essa secagem impede que os esporos germinem
entre as placas de vidro.
Anotar a espécie do cogumelo e a
data de coleta dos esporos com a caneta de ponta porosa. Colocar as
placas já seladas com o esparadrapo (ou com Parafilm) dentro de sacos
grossos de polipropileno (PP) e usar uma seladora de sacos plásticos
para fechar o saquinho em torno da placa, deixando uma folga em torno
da
mesma.
Armazenar as placas (seladas dentro
dos sacos de PP) na geladeira (não congelar), onde poderão ficar guardadas
por vários anos. Em minha coleção possuo esporos de Stropharia rugoso-annulata
que estão armazenados desde 1994 e que ainda germinam muito bem.
Para germinar os esporos , transferir
com o auxílio da alça metálica , um pouco dos esporos para um tubo
com ágar inclinado (com antibiótico), para que ocorra sua germinação.
Os procedimentos são feitos do seguinte modo:
1.1.2)
Germinação de esporos - Procedimento
1) Colocar
a máscara cirúrgica e desinfetar a bancada de trabalho e as mãos com álcool
(cuidado!).Deixar todo o álcool evaporar.
2) Acender
o bico de Bunsen e flambar a alça metálica na chama do bico de Bunsen
até ficar
avermelhada .Depois disso, deixar esfriar próximo à chama, apoiada
no suporte (CLIQUE
AQUI)
3) Abrir
um tubo de ágar inclinado (ágar com antibiótico), flambar a boca do
tubo na chama do bico de Bunsen.
4) Introduzir
a alça metálica no tubo e tocar a superfície do ágar para que esfrie
e também para que fique aderido um pouco do ágar. Passar essa
alça
sobre um pouco dos esporos coletados na placa de vidro citada acima.
Evitar
abrir
muito
as placas
de vidro e tocar os esporos somente com a ponta esterilizada da alça.
Também
evitar tocar com a alça , qualquer local que não seja
a superfície coberta de esporos.
5) Voltar
a introduzir a alça metálica no tubo de ágar inclinado e espalhar os
esporos em zig-zag sobre a superfície do meio de cultura dentro do
tubo. Flambar a boca do tubo de ensaio, fechá-lo com a tampa rosqueável
e marcar os dados relativos à espécie de cogumelo utilizada e a data
de inoculação, colocando o tubo na estante.
6) Devido
ao fato do cogumelo já poder estar contaminado com bactérias e esporos
de bolores , devemos fazer várias inoculações de esporos para que se
obtenha ao menos 2 ou 3 culturas livres de contaminações , usando meio
de cultura com antibiótico para controlar o crescimento de bactérias.
Armazenar os tubos inoculados com os esporos em local limpo isento
de poeira e com temperatura em torno de 25ºC para promover o crescimento
do micélio proveniente da germinação dos esporos.
Deve-se observar diariamente o desenvolvimento
do micélio nos tubos que deverá ter aspecto branco e livre de pontos
coloridos (verde,azul,etc) ou aspecto leitoso e com odor de fermentação,
que indicam a presença de contaminantes. Qualquer tubo que apresentar
problemas de contaminação deve ter seu conteúdo descartado e o tubo
lavado para ser reaproveitado.
7) Dos
tubos que não apresentarem sinais de contaminação ,devemos repicar
sómente o micélio que apresentar crescimento mais rápido para outros
tubos com meio de cultura .(vide inoculação
de ágar). Esses tubos repicados deverão ser avaliados nas fases
seguintes , que são a produção de sementes em grãos de trigo e a produção
do cogumelo em composto. Muitas vezes um contaminante só irá aparecer
quando for transferido para os grãos de cereais.
A cultura é iniciada retirando-se
um pedaço do interior do cogumelo e depositando-se esse pedaço em um
meio nutrivo solidificado com ágar onde o micélio irá se desenvolver.
Com esse tipo de procedimento obtemos culturas com características
próximas à da cultura inicial. Esse tipo de reprodução é chamada de
assexuada ,onde basicamente faz-se um clone do organismo original.
Para obtermos uma cultura através
da “clonagem” do cogumelo devemos proceder conforme abaixo:
1) Colocar
a máscara cirúrgica e desinfetar a bancada de trabalho e as mãos com álcool
(cuidado!). Aguardar que o álcool evapore
para acender o bico de Bunsen. A função da chama de gás é produzir
uma área estéril em sua proximidade e portanto ao se trabalhar com
os materiais próximos à mesma ,tem-se assegurada a transferência de
micélio sem introdução de contaminantes carregados pelo ar , porém
o restante do material que vai entrar em contato com o meio de cultura
já deverá estar também esterilizado .
2) Selecionar
um cogumelo que não seja muito novo e nem muito velho (deve estar na
fase ideal de crescimento).
3) Partir
o cogumelo com as mãos (rasgá-lo) de forma a expor seu interior. Não
devemos cortá-lo com faca ou estilete pois estaremos introduzindo contaminações
da parte externa do cogumelo para seu interior.
4) Flambar
a lâmina do bisturi e a haste metálica e colocá-las para esfriar no
suporte .Cortar com o bisturi (pode usar também a pinça flambada e
resfriada préviamente), um pedaço de mais ou menos 2 ou 3 mm do interior
do cogumelo próximo à área do chapéu , porém longe da superfície exterior
e da região das lamelas (onde se produzem os esporos) e que apresente
coloração clara. Algumas espécies de cogumelos tem os pés fibrosos
, o que dificulta o corte com o bisturi , portanto evitar coletar material
dessa área. Com o auxílio da haste metálica (já flambada e resfriada)
pegar o pedaço do cogumelo que ficou aderido à lamina do bisturi e
transferir esse pedacinho para um tubo de ágar inclinado com meio de
cultura novo. Flambar a boca do tubo, fechar com a tampa rosqueável
; anotar os dados do cogumelo e data de inoculação com caneta de ponta
porosa e colocar o tubo na estante.
Colocar os tubos com o micélio para
incubar em uma estufa a 25ºC ou em ambiente limpo e escuro com temperatura
em torno de 25ºC. Passados alguns dias , observa-se o início de crescimento
do micélio sobre o pedaço de cogumelo. Esse micélio começará depois
a crescer da superfície do pedaço do cogumelo para a superfície do ágar.
5) Deve-se
observar diáriamente o desenvolvimento do micélio nos tubos que deverá ter
aspecto branco e livre de pontos coloridos (verde,azul,etc) ou com
aspecto leitoso e com cheiro de fermentação , que indicam a presença
de contaminantes. Qualquer tubo que apresentar problemas de contaminação
deve ter seu conteúdo descartado e o tubo lavado para ser reaproveitado.
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